Cellular droplet microarray: a miniaturized technique for high-throughput screening of small molecules and proteins

Das Hochdurchsatz-Screening ist von großer Bedeutung und bildet einen der Eckpfeiler der aktuellen Life-Science-Research wie Biologie, Biotechnologie, Biochemie, Computerwissenschaft, medizinische Chemie und Pharmakologie. Das Interesse an einem Screening mit hohem Durchsatz unter akademischen, mittleren und kleinen Biotech-Unternehmen, staatlichen und gemeinnützigen Screening-Standorten, sowie Auftragsforschungsorganisationen wurde spürbar erhöht, da Hochdurchsatz-Screenings eine effiziente Analyse von einer Vielzahl von Stoffen in kürzester Zeit ermöglicht. Das steigende Interesse an dieser Methode führte zu einer schnellen Entwicklung von Screening-Technologien mit hohem Durchsatz in Kombination mit komplementären Technologien. Die Nachteile herkömmlicher Hochdurchsatz-Screenings beinhalten hohe Kosten und Materialverschwendung, lange Zykluszeiten, geringe Produktivität und die begrenzte Ausbaufähigkeit der existierenden Stoffbibliotheken. Die genannten Nachteile verdeutlichen die Wichtigkeit der Bemühungen zur Entwicklung von verbesserten miniaturisierten und automatisierten Hochdurchsatz-Screening Methoden. Droplet Microarray (DMA) ist eine dieser miniaturisierten Plattformen, welche durch die Vereinigung von Oberflächenchemie, Oberflächenfunktionalisierung und Biologie erschaffen wurde. Die hohe Tröpfchendichte auf DMA senkt die Kosten, Materialverschwendung, Zykluszeit des Screenings und erhöht die Effizienz des Verfahrens, während sie effektiv die Verwendung größerer chemischer und biologischer Bibliotheken unterstützt. Die weitere Entwicklung, Auswertung und Verbesserung der DMAs spielt nicht nur für den Fortschritt der Hochdurchsatz-Screenings eine wichtige Rolle, sondern beherbergt auch unermessliches Potential in pharmalogischen Bereichen und der Stammzellenforschung, in welcher es die Wirksamkeit von Gentransfers und das Kultivieren von undifferenzierten Stammzellen erleichtert. Pharmakologisches Priming (Drug Repurposing) wurde als adjuvante Strategie zur Verbesserung der Effizienz nicht-viraler Genübertragung angesehen. Dennoch ist die facettenreiche Anwendung des pharmakologischen Priming aufgrund der unerschwinglich hohen Kosten für Reagenzien und die Durchführung der Methode unweit verbreitet, was den aufkommenden Drang nach miniaturisierten Plattformen und Drug Repurposing erklärt. Abgesehen von der Dringlichkeit im pharmakologischen Bereich, um klinisches Potenzial zu realisieren, benötigt die Stammzellenforschung auch miniaturisierte Methoden um den Einfluss von Zelloberflächeninteraktionen und Zellkulturmedium auf das Verhalten von Stammzellen und die Effekte von Zusatzstoffen, und Oberflächenbeschichtungen einschließlich oberflächenabsorbierter Proteine auf Stammzellen zu beobachten. Das Ziel für den ersten Teil der Dissertation war es nach kleinen Molekülen (Stoffen) auf DMAs zu suchen, welche transfektionsverstärkende Effekte beinhalten, um eine mögliche Verbesserung in den Bereichen Gentransfer- und Therapie zu bieten. Eine Untersuchung der Einflüsse von 774 Food and Drug Administration (FDA)-zugelassenen Wirkstoffen auf die Transfektionseffizienz mit verschiedenen Zelltypen in miniaturisierter- und hochdurchsatzweise wurde mit Hilfe der DMAs veranlasst. Das Screening der FDA-zugelassenen Arzneimittelbibliothek identifizierte 14 einzelne Verbindungen, die eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektion aufwiesen. Diese Treffer wurden verifiziert und in großem Maßstab untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der auf DMA basierende Ansatz für das Drug Repurposing beständig ist und zur Untersuchung und Entwicklung wirksamerer nicht-viraler Genübertragungssysteme verwendet werden könnte. Das Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war es, den Einfluss von Oberflächeneigenschaften und sinkendem Volumen auf die Pluripotenz von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu bestimmen. Zwei künstliche Oberflächen mit unterschiedlichen chemischen Elementen und deren dazugehörigen DMAs wurden für die Kultivierung und Pluripotenz von hiPSCs in vitro untersucht. Die Oberflächen und DMAs wurden genutzt, um human induzierten pluripotenten Stammzellen in 2 ml und 200 nL-Volumen zu kultivieren. Die Ergebnisse zeigten, dass hiPSCs eine hohe Lebensfähigkeit, sowie die erwartete Morphologie und Pluripotenz in 200 nL Tröpfchen auf Typ A und Typ B DMAs ohne Matrigelbeschichtung nach 24 h Kultivierung aufwiesen. Dies beweist, dass DMAs eine vielseitige und simple Plattform für kurzzeitige und xeno-freie Hochdurchsatz-Screenings von hiPSCs sind. Als Ziel für den dritten Teil der Dissertation wurde das Identifizieren von chemisch definierten Proteinen, welche das Kultivieren und Aufrechterhalten der Plutipotenz von hiPSCs Zellen auf DMAs, sowie Mikrotiterplatten weiter verbessern könnten, angesetzt. Es ist möglich eine Proteinbeschichtung, Zellkultur und Immunfluoreszenzfärbung auf miniaturisierter Ebene parallel mit Hilfe von DMAs durchzuführen, was zu einer Reduzierung von Versuchsfehlern und Verbrauchsmaterialien führt. Auf Grund dessen wurden DMAs als Basis zur Überprüfung von elf verschiedenen Proteinen und deren verwandten binären und ternären Kombinationen (insgesamt 231 verschiedene Gruppen) auf ihre Fähigkeit zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs genutzt. Aus diesem Raster wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche die Proliferation und das Self-Renewal besser unterstützen könnten als mit Matrigel beschichtete Oberflächen. Die effizientesten Proteinkombinationen des primären Screenings wurden weiterhin in einer Langzeitkultur (fünf Wochen) verifiziert. Zusätzlich wurde die Formation von embryonalen Körperchen der auf den ausgewählten Proteinbeschichtungen kultivierten Zellen erzielt und es folgte die Differenzierung der hiPSCs in drei Keimblätter. Zusammengefasst, wurden DMAs als miniaturisierte Schnellscreening-Plattform verwendet, um mehrere biologische Fragen zu beantworten. Als erstes wurden 776 Wirkstoffe auf Nanoebene untersucht und somit kosten-, zeit- und arbeitssparend verwertet. Vierzehn Stoffe wiesen eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektionstechniken auf. Als zweites wurden chemische Komponente von Zellkulturoberflächen und kleinen Volumina (200nl) von Zellkulturmedium gefunden, die zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs beitragen. Als letztes wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche das Kultivieren von undifferenzierten hiPSCs unterstützen. Zwei von ihnen wurden weiter untersucht, um eine Langzeitkultur von undifferenzierten hiPSCs zu erzielen, gefolgt von ihrer Differenzierung in drei Keimblätter. Eine Zusammenfassung und eine Aussicht auf die Zukunft befinden sich am Ende der Dissertation

Information-based Optimal Subdata Selection for Clusterwise Linear Regression

Mixture-of-Experts models are commonly used when there exist distinct clusters with different relationships between the independent and dependent variables. Fitting such models for large datasets, however, is computationally virtually impossible. An attractive alternative is to use a subdata selected by ``maximizing" the Fisher information matrix. A major challenge is that no closed-form expression for the Fisher information matrix is available for such models. Focusing on clusterwise linear regression models, a subclass of MoE models, we develop a framework that overcomes this challenge. We prove that the proposed subdata selection approach is asymptotically optimal, i.e., no other method is statistically more efficient than the proposed one when the full data size is large.Comment: 23 pages, 5 figure

Representation and Matching of Articulated Shapes

We consider the problem of localizing the articulated and deformable shape of a walking person in a single view. We represent the non-rigid 2D body contour by a Bayesian graphical model whose nodes correspond to point positions along the contour. The deformability of the model is constrained by learned priors corresponding to two basic mechanisms: local non-rigid deformation, and rotation motion of the joints. Four types of image cues are combined to relate the model configuration to the observed image, including edge gradient map, foreground/background mask, skin color mask, and appearance consistency constraints. The constructed Bayes network is sparse and chain-like, enabling efficient spatial inference through Sequential Monte Carlo sampling methods. We evaluate the performance of the model on images taken in cluttered, outdoor scenes. The utility of each image cue is also empirically explored

Spatial-temporal Transformers for EEG Emotion Recognition

Electroencephalography (EEG) is a popular and effective tool for emotion recognition. However, the propagation mechanisms of EEG in the human brain and its intrinsic correlation with emotions are still obscure to researchers. This work proposes four variant transformer frameworks~(spatial attention, temporal attention, sequential spatial-temporal attention and simultaneous spatial-temporal attention) for EEG emotion recognition to explore the relationship between emotion and spatial-temporal EEG features. Specifically, spatial attention and temporal attention are to learn the topological structure information and time-varying EEG characteristics for emotion recognition respectively. Sequential spatial-temporal attention does the spatial attention within a one-second segment and temporal attention within one sample sequentially to explore the influence degree of emotional stimulation on EEG signals of diverse EEG electrodes in the same temporal segment. The simultaneous spatial-temporal attention, whose spatial and temporal attention are performed simultaneously, is used to model the relationship between different spatial features in different time segments. The experimental results demonstrate that simultaneous spatial-temporal attention leads to the best emotion recognition accuracy among the design choices, indicating modeling the correlation of spatial and temporal features of EEG signals is significant to emotion recognition

Image-based Stability Quantification

Quantitative evaluation of human stability using foot pressure/force measurement hardware and motion capture (mocap) technology is expensive, time consuming, and restricted to the laboratory. We propose a novel image-based method to estimate three key components for stability computation: Center of Mass (CoM), Base of Support (BoS), and Center of Pressure (CoP). Furthermore, we quantitatively validate our image-based methods for computing two classic stability measures, CoMtoCoP and CoMtoBoS distances, against values generated directly from laboratory-based sensor output (ground truth) using a publicly available, multi-modality (mocap, foot pressure, two-view videos), ten-subject human motion dataset. Using Leave One Subject Out (LOSO) cross-validation, experimental results show: 1) our image-based CoM estimation method (CoMNet) consistently outperforms state-of-the-art inertial sensor-based CoM estimation techniques; 2) stability computed by our image-based method combined with insole foot pressure sensor data produces consistent, strong, and statistically significant correlation with ground truth stability measures (CoMtoCoP r = 0.79 p < 0.001, CoMtoBoS r = 0.75 p < 0.001); 3) our fully image-based estimation of stability produces consistent, positive, and statistically significant correlation on the two stability metrics (CoMtoCoP r = 0.31 p < 0.001, CoMtoBoS r = 0.22 p < 0.043). Our study provides promising quantitative evidence for the feasibility of image-based stability evaluation in natural environments

Representation of Maximally Regular Textures in Human Visual Cortex

This research was supported by National Science Foundation INSPIRE Grant 1248076, which was awarded to Y.L. and A.M.N.Peer reviewedPublisher PD

High‐Throughput Screening of Cell Transfection Enhancers Using Miniaturized Droplet Microarrays

DNA delivery is a powerful research tool for biological research and clinical therapies. However, many nonviral transfection reagents have relatively low transfection efficiency. It is hypothesized that by treating cells with small molecules, the transfection efficiency can be improved. However, in order to identify such transfection-enhancing molecules, thousands of molecules must be tested. Current high-throughput screening (HTS) technologies based on microtiter plates are not suitable for such screenings due to the prohibitively high costs of reagents and operation. Here, the use of the droplet microarray (DMA) platform to screen 774 FDA-approved drugs with CHO-K1, Jurkat and HEK293T cells is reported. The volume of individual aqueous compartments is 20 nL, requiring 0.84 mL of cell suspension and 200 pmoles of each drug (total 0.02 moles) to perform the screening. Thus, the requirement for cells and reagents is 2500 times less than that for the same experiment performed in 384-well plates. The results reveal the potential of the DMA platform as a more cost-effective and less labor-intensive approach to HTS. Furthermore, an increase (approximately two- to fivefold) in transfection efficiency is achieved by treating cells with some molecules. This study clearly demonstrates the potential of the DMA platform for miniaturization of biochemical and cellular HTS